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    鴨瘟抗體(DVE Ab)酶聯(lián)免疫分析,您了解多少?

    發(fā)布時(shí)間: 2014-10-07  點(diǎn)擊次數(shù): 963次

    鴨瘟抗體(DVE Ab)酶聯(lián)免疫定性
    實(shí)驗(yàn)原理
    本試劑盒應(yīng)用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中鴨瘟抗體(DVE Ab)表達(dá)。用純化的抗原包被微孔
    板,制成固相抗原,可與樣品中鴨瘟抗體(DVE Ab)相結(jié)合,經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和
    其他成分后再與 HRP 標(biāo)記的抗原結(jié)合,形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物,經(jīng)過(guò)*洗滌后
    加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃
    色。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),與 CUTOFF 值相比較,從而判定標(biāo)本
    中鴨瘟抗體(DVE Ab)的存在與否。
    鴨瘟抗體(DVE Ab)標(biāo)本要求
    1.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能
    馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融
    2.不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。
    操作步驟
    1.
    編號(hào):將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照 2 孔、陽(yáng)性對(duì)照 2 孔、空白對(duì)照 1
    孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)
    2.
    加樣:分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照 50µl。然后在待測(cè)樣品孔先
    加樣品稀釋液 40µl,然后再加待測(cè)樣品 10µl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不
    觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,
    3.
    溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
    4.
    配液:將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
    5.
    洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此
    重復(fù) 5 次,拍干。
    6.
    加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑 50µl,空白孔除外。
    7.
    溫育:操作同 3。
    8.
    洗滌:操作同 5。
    9.
    顯色:每孔先加入顯色劑 A50µl,再加入顯色劑 B50µl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
    10 分鐘.
    10. 終止:每孔加終止液 50µl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn))。
    11. 測(cè)定:以空白空調(diào)零,450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD 值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止
    液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
    計(jì)算和結(jié)果判定:
    試驗(yàn)有效性:陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.10
    臨界值(CUT OFF)計(jì)算:臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
    陰性判定:樣品 OD 值< 臨界值(CUT OFF)者為鴨瘟抗體(DVE Ab)陰性
    陽(yáng)性判定:樣品 OD 值≥ 臨界值(CUT OFF)者為鴨瘟抗體(DVE Ab)陽(yáng)性

    鴨瘟抗體(DVE Ab)注意事項(xiàng)
    1.操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
    2.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未
    用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
    3.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
    4. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
    5.底物請(qǐng)避光保存。
    6.試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí),參考波長(zhǎng)為 630nm
    7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為 2M 的硫酸,使用時(shí)必須
    注意安全。

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